Причиной отсутствия агглютинации могут быть следующие факторы

Ошибки при определении групп крови

Регистрационные удостоверения

Разновидности ошибок при определении групп крови: технические, вызванные применением некачественных реагентов, обусловленные биологическими особенностями анализируемых образцов.

Технические причины

1. Некорректное расположение реагентов на планшете.
2. Нарушение количественного отношения цоликлонов и эритроцитов.
3. Недостаточная стерильность планшетов и пипеток.
4. Неверная запись в историю болезни.
5. Несоблюдение времени реакции агглютинации. В случае ожидания менее 5 минут реакция может не наступить при наличии слабых агглютиногенов. При передержанной реакции подсыхание капель с краев может симулировать ложноположительный результат.
6. Температура воздуха свыше 25 °C. Рекомендуется использовать специальные реагенты с поправкой на температурные условия, опускать внешнюю часть планшета в холодную воду.
7. Недостаточное или избыточное центрифугирование. В первом случае возможны ложноположительные результаты, во втором — ложноотрицательные.

Низкое качество реагентов

1. Титр цоликлонов менее 1:32, использование просроченных реагентов вызывают позднюю или слабо выраженную реакцию.
2. Загрязнение и недостаточная консервация цоликлонов и стандартных эритроцитов вызывает «бактериальную» агглютинацию.

Биологические особенности эритроцитов

1. Слабые формы антигенов эритроцитов вызывают позднюю и слабо выраженную агглютинацию. Во избежание ошибок определения групп крови осуществляют повторное исследование с другой серией цоликлонов и увеличенным временем реакции, применяют моноклональные антитела Анти-Aсл., проводят типирование перекрестным способом со стандартными эритроцитами.
2. «Панагглютинация» вызывает неспецифическую агглютинацию со всеми сыворотками. Онкологические и гематологические пациенты попадают в группу риска. Для устранения «аутоагглютинации» используют трехкратное отмывание эритроцитов. Планшет прогревают в течение 5 минут в термостате при 37 °C. В ряде случаев предварительно подогревают пробирку, реактивы, раствор NaCl.
3. «Монетные столбики» эритроцитов. По окончании исследования в поле реакции рекомендуется добавить 1 — 2 капли 0,9 % раствора NaCl и покачать планшет.
4. Неполная агглютинация. Частичная агглютинация эритроцитов может возникать после пересадки пациенту костного мозга или в первые месяцы после трансфузии крови 0(I). Для окончательного типирования антигенов по системам AB0 и Резус рекомендуется использование ID-гелевых карт.

Биологические особенности антител

1. Выявление иммунных антител, возникших в результате предшествующей сенсибилизации. Больному с иммунными антителами требуется индивидуальный подбор донора.
2. Возникновение «монетных столбиков». Сомнительный результат подтверждают со стандартными эритроцитами 0(I). Для распознавания истинной агглютинации добавляют изотонический раствор и покачивают планшет.
3. Отсутствие Анти-A и Анти-B-антител. Встречается у младенцев и больных с угнетением гуморального иммунитета.
4. Присутствие в сыворотке специфических и неспецифических холодовых антител. В случае наличия неспецифических агглютининов агглютинация пропадает во время проведения исследования при 37 °C. Взаимодействие сыворотки со стандартными эритроцитами 0(I) говорит о присутствии специфических холодовых антител. Специфичность антител определяется с помощью типированных по системам P и MNS эритроцитов.

Список литературы

• Рагимов, А.А. Трансфузионная иммунология/А.А. Рагимов, Н.Г. Дашкова. — М.: Медицинское информационное агентство, 2004. — 279 с.
• Шевченко, Ю.Л. Безопасное переливание крови/Ю.Л. Шевченко, Е.Б. Жибурт. — СПб.: Питер, 2000. — 308 с.

Патенты

Галерея 1

Планшет для типирования крови человека по антигенам эритроцитов

Регистрационное удостоверение на медицинское изделие. ТУ 22.29.29−001−06125010−2017. № РЗН 2018/6730 от 02 марта 2020 года

Планшет для типирования крови человека по антигенам эритроцитов

Приложение к регистрационному удостоверению на медицинское изделие. ТУ 22.29.29−001−06125010−2017. № РЗН 2018/6730 от 02 марта 2020 года

Набор реагентов для изосерологических исследований in vitro (Иммуногем-Сангвитест)

Регистрационное удостоверение на медицинское изделие. ТУ 21.20.23-002-06125010-2018. № РЗН 2019/8361 от 02 марта 2020 года

Набор реагентов для изосерологических исследований in vitro (Иммуногем-Сангвитест)

Приложение к регистрационному удостоверению на медицинское изделие. ТУ 21.20.23-002-06125010-2018. № РЗН 2019/8361 от 02 марта 2020 года

Галерея 2

Патент на промышленный образец 105908

Планшет для типирования крови человека по антигенам эритроцитов. Патентообладатель, автор: Чмелев Вадим Мстиславович, генеральный директор ООО

Патент на промышленный образец 109688

Планшет для типирования крови человека по антигенам эритроцитов. Патентообладатель, автор: Чмелев Вадим Мстиславович

Патент на промышленный образец 109689

Планшет для типирования крови человека по антигенам эритроцитов. Патентообладатель, автор: Чмелев Вадим Мстиславович

Источник

АГГЛЮТИНАЦИЯ

Агглютинация (позднелатинское agglutinatiq — склеивание) — склеивание и выпадение в осадок корпускуллярных частиц — бактерий, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, клеток тканей, корпускулярных химически активных частиц с адсорбированными на них антигенами или антителами, взвешенных в среде электролитов.

Антитела, вызывающие реакцию Агглютинацию, называют агглютининами, а антигены, участвующие в реакции,- агглютиногенами. Агглютинины называют обычно соответственно клеткам, которые взяты в реакцию. Так, например, агглютинины против эритроцитов — гемагглютининами, против лейкоцитов — лейкоагглютининами и т. д.

Различают агглютинины полные и неполные. Реакция Агглютинации позволяет обнаруживать антитела в сыворотке крови, экстрактах тканей, секретах организма при инфекционных заболеваниях, при ауто-, изо- и гетероиммунизации (см. Группы крови, Иммуногематология), аллергических состояниях.

Реакция Агглютинации может быть специфической, неспецифической и спонтанной. Специфическая реакция Агглютинации возникает под влиянием сывороток животных или человека (см. Антитела), иммунизированных различными антигенами (см. Антигены, Антиген — антитело реакция), или нормальных сывороток человека. Неспецифическая реакция Агглютинации возникает, когда агрегация и выпадение в осадок корпускулярных частиц происходит под влиянием изменения факторов внешней среды (pH среды, концентрации солей, повышения или понижения температуры и др.).

К неспецифической реакции агглютинации может быть отнесена реакция Агглютинации эритроцитов человека и животных (см. Гемагглютинация) под действием водных экстрактов из семян и плодов некоторых видов растений.

Среди растений, главным образом бобовых, были обнаружены гемагглютинины, обладающие и специфической способностью агглютинировать эритроциты человека только определенных серологических типов. Антителам, содержащимся в солевых экстрактах плодов и семян многих видов растений (фитогемагглютинины), присущи свойства, наблюдающиеся у агглютининов специфических сывороток, полученных от иммунизированных животных. Эти фитогемагглютинины получили название лектинов (см.).

Спонтанная реакция Агглютинации наблюдается в случаях, когда бактерии при размножении не делятся на отдельные клетки, а остаются связанными между собой в цепи или гроздья. Такие суспензии не гомогенны. Часть культуры всегда находится в осадке. Под действием бактерий и вирусов эритроциты могут давать спонтанную Агглютинацию.

В инфекционной иммунологии реакция специфической Агглютинации применяется для диагностики различных инфекционных заболеваний, для идентификации микроорганизмов, выделенных от больных и бактерионосителей, для изучения иммунного ответа организма при инфекции и профилактической иммунизации.

Впервые реакция Агглютинации бактерий была описана Шарреном и Роже (A. Charrin, G. Н. Roger, 1890) и И. И. Мечниковым (1891). Практическое применение реакции Агглютинации было предложено Грубером, Дархемом и Видалем (M. Gruber, H. E. Durham, F. Widal, 1896) для диагностики брюшного тифа (см. Видаля реакция).

Реакция Агглютинации бактерий выполняется в пробирках в объеме 1 мл (макроскопическая развернутая реакция Агглютинации). В штатив устанавливается ряд пробирок с номерами. Во все пробирки, кроме первой, наливают изотонический раствор хлорида натрия, затем в первую и вторую пробирки вносят 1 мл иммунной сыворотки в разведении 1 : 100. После смешивания из второй пробирки забирают 1 мл сыворотки в разведении 1 : 200 и переносят я третью пробирку и т. д. Из предпоследней пробирки 1 мл разведенной сыворотки выливают. В последнюю пробирку сыворотку не вносят. В каждую пробирку добавляют по две капля густой взвеси изучаемых бактерия (2 млрд. микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту) и энергично встряхивают. Последняя пробирка является контролем гомогенности культуры изучаемых бактерий. Количество антигена в каждой пробирке одинаково. Первая фаза реакции протекает при t° 37° в термостате в течение 2 час., затем 18 час. при комнатной температуре. Учитывают показания реакции Агглютинации, как правило, невооруженным глазом. В последней, контрольной, пробирке должна быть равномерная взвесь бактерий.

Реакция Агглютинации оценивается следующим образом:

++++ полная агглютинация, жидкость прозрачна, культура в осадке;

+++ неполная агглютинация, жидкость не полностью прозрачна, имеется осадок;

++ слабая агглютинация, жидкость не прозрачна, имеется осадок;

+ следы агглютинации, жидкость не прозрачна, небольшой осадок;

— отрицательная реакция, во всех пробирках взвесь равномерно мутная, осадка нет.

За титр сыворотки принимается ее разведение, давшее реакцию Агглютинации на + + при полном отсутствии Агглютинации в контрольной пробирке.

Осадок, выпадающий при положительной реакции Агглютинации, может иметь вид крупных рыхлых хлопьев пли мелких компактных зерен. Крупнохлопчатый осадок образуют бактерии, имеющие два антигена: жгутиковый — Н-антиген и соматический — О-антиген (см. Бактерии, антигены бактерий). Крупные хлопья при полной Агглютинации выпадают в осадок в течение 2-4 час. Мелкозернистый осадок образуют бактерии, не имеющие жгутиков. Эти бактерии имеют только один соматический антиген. В процессе Агглютинации тела бактерий склеиваются и медленно (в течение 18 часов) выпадают в осадок.

С целью более точного определения степени проявления реакции Агглютинации применяют различные приборы: агглютиноскоп, фотоэлектрический денситометр, фотоэлектрический колориметр, спектрофотометр.

В практической работе применяется капельный метод постановки реакции Агглютинации в пробирках и на предметном стекле. Предложено несколько модификаций капельного метода постановки реакции Агглютинации, начиная от смешивания неразведенной специфической сыворотки с равным количеством исследуемой бактериальной культуры до разведения сыворотки 1 : 400.

Результаты реакции Агглютинации на предметном стекле учитывают через 5 мин. при постоянном покачивании предметного стекла или через 30 мин., если предметное стекло находится во влажной камере. Реакция Агглютинации на предметном стекле чаще употребляется как ориентировочная (см. Нобля реакция). Можно снять половину колонии изучаемой культуры бактерий в твердой питательной среды и в реакции Агглютинации на предметном стекле определить их вид. Реакция Агглютинации на предметном стекле полностью удовлетворяет цели исследования, если применяются адсорбированные монорецепторные сыворотки.

Часто специфические сыворотки, полученные от иммунизированных животных или больных людей, дают положительную реакцию Агглютинации не с одним предполагаемым возбудителем заболевания, а и с другими видами микроорганизмов. Так, например, сыворотка больных брюшным тифом может агглютинировать в высоких титрах не только брюшнотифозную палочку, но и бактерии, вызывающие паратиф А и В (групповая Агглютинация). Это указывает на общность антигенов этих бактерий. Принято считать, что заболевание вызвал микроорганизм, который агглютинируется сывороткой больного в более высоком титре, чем другие виды бактерий. По различие титров в реакции Агглютинации нередко бывает незначительным, и в этих случаях применяют метод адсорбции агглютининов (см. Кастеллани метод). Он основан на том, что специфическую сыворотку насыщают несколькими культурами, которые агглютинируются этой сывороткой. В пробирке, где добавлена специфическая культура, адсорбируются все агглютинины, а там, где добавлена неспецифическая культура, адсорбируются только групповые агглютинины (специфические остаются свободными).

В целях повышения чувствительности реакции Агглютинации часто применяется пассивная реакция Агглютинации. Сущность этой реакции состоит в том, что специфические антигены и антитела взаимодействуют на поверхности инертных частиц, которые при положительной реакции выпадают в осадок. В качестве корпускулярных частиц для адсорбции антигенов и антител были предложены различные адсорбенты, но для практического применения приемлемы только те, которые обладают высокой адсорбционной емкостью, однородностью частиц и наименьшей склонностью к спонтанной Агглютинации. К таким адсорбентам относятся эритроциты человека и животных, частицы латекса, коллодия, бентанита и др.

Реакция пассивной Агглютинации с диагностической целью была предложена А. Т. Кравченко (1943) и М. И. Соколовым (1945). Эритроциты человека нагружались гаптенами, приготовленными из бактериальных клеток возбудителей инфекционных заболеваний. Эти эритроциты приобретали способность агглютинироваться под действием специфической сыворотки.

Предложено несколько модификаций пассивной реакции Агглютинации нагруженных нативных эритроцитов и реакция торможения пассивной Агглютинации нагруженных эритроцитов. Эритроциты человека и животных, предварительно обработанные таниновой кислотой, приобретают способность в большей степени адсорбировать на своей поверхности белковые антигены (см. Бойдена реакция). Обработка эритроцитов таниновой кислотой сближает их свойства с индифферентными частицами.

Для практических целей были предложены эритроцитарные диагностикумы — эритроциты, нагруженные антигенами различных видов бактерий или антителами. Эритроцитарные диагностикумы приготовляются для диагностики брюшного тифа, дизентерии, холеры и других желудочно-кишечных заболеваний, а также чумы, коклюша, сыпного тифа. Кроме того, эритроцитарные диагностикумы применяются при исследовании природы аллергических реакций.

Практическое применение нашел так называемый латекс-тест. Частицы латекса являются промежуточным продуктом синтеза каучука. Взвесь частиц латекса размером 0,79-0,81 мкм выпускается специально для серологических исследовании. Исходная взвесь латекса фильтруется для удаления частиц большего размера. Взвесь частиц латекса разводится в отношении 1 : 10 боратным или глициновым буфером (pH=8,2). Приготовленную взвесь «нагружают» антигеном или антителами в соотношении 1:10 и выдерживают при 37° 2 часа.

Частицы латекса, нагруженные антигеном или антителами, можно использовать в реакции определения неизвестного антигена по известной сыворотке или по известному антигену определяют неизвестную сыворотку. Две капли разведенной буфером неизвестной сыворотки, предварительно прогретой при 56° в течение 30 мин., смешивают на предметном стекле с одной каплей нагруженных антигеном частиц латекса. Реакция наступает, как правило, быстро (2 — 3 мин.) и только в некоторых случаях требуется выдержать 30 мин. при t° 37°. Наступившая реакция Агглютинации частиц латекса хорошо видна невооруженным глазом на темпом фоне или под малым увеличением микроскопа.

Реакция Агглютинации широко используется для обнаружения антиэритроцитарных антител, а также антигенов в эритроцитах (см. Группы крови).

Важное значение, особенно в последнее время, приобрела реакция Агглютинации лейкоцитов (лейкоагглютинация). При помощи реакции лейкоагглютинации производится типирование лейкоцитарных антигенов, имеющих большое значение в проблеме трансплантации (см.).

Для постановки реакции лейкоагглютинации используют сыворотки, полученные от многорожавших женщин, сыворотки больных после многократных переливаний крови, содержащие антилейкоцитарные антитела. Реакция Агглютинации лейкоцитов производится с лейкоцитами, полученными из крови или лимфатических узлов (лимфоциты), ex tempore, так как лейкоциты, выделенные из крови, сохраняют жизнеспособность только 6 час.

При выделении лейкоцитов из крови необходимо принять все меры предосторожности, избегая повреждения клеток. Методы получения лейкоцитов из крови для реакции Агглютинации основаны на разной скорости оседания лейкоцитов и эритроцитов из дефибрированной крови. 10 мл изотонического раствора хлорида натрия, содержащего 2,5 г желатины, 3 г лимоннокислого натрия и 3 г сахарозы, при смешивании с кровью в соотношении 10 : 3 осаждают эритроциты полностью в течение 30 мин. В надосадочной жидкости остаются лейкоциты и тромбоциты. Осторожное центрифугирование надосадочной жидкости при 800 об/мин в течение 4 мин. позволяет получить лейкоциты в осадке, а тромбоциты в надосадочной жидкости. Осадок, состоящий из лейкоцитов, отмывают раствором еще дважды.

Получение лейкоцитов должно производиться при низкой температуре и в условиях стерильности, так как бактериальное загрязнение взвеси лейкоцитов влечет за собой спонтанную Агглютинацию.

Для лейкоагглютинации рекомендуется использовать взвесь лейкоцитов, содержащую от 3000 до 5000 лейкоцитов в 1 мкл (подсчет в камере Горяева). Сыворотку перед постановкой реакции лейкоагглютинации прогревают при t° 56° в течение 30 мин.

Реакция проводится в пробирках, на стекле с лунками или на пластинах органического стекла с лунками. Реагирующие жидкости берутся в соотношении 0,1 мл разведенной сыворотки на 0,05 мл взвеси лейкоцитов.

Объем реагирующей смеси можно варьировать. Смесь выдерживают при t° 37° в течение 1 часа. Затем в каждую пробирку добавляют по одной капле 3% раствора уксусной к-ты для удаления оставшихся при промывке эритроцитов. Реакцию лейкоагглютинации учитывают под малым увеличением микроскопа. Оценку показания реакции начинают с контрольной пробирки. Положительную реакцию оценивают, как обычную реакцию Агглютинации любых взвешенных частиц, по четырехбалльной системе.

Для изучения антигенного состава тромбоцитов (см.), а также обнаружения антитромбоцитарных антител в сыворотке больных после много кратных переливаний крови применяют реакцию Агглютинации тромбоцитов. Сложность постановки реакции Агглютинации тромбоцитов заключается в получении взвеси тромбоцитов без признаков спонтанной Агглютинации. Для получения такой взвеси тромбоцитов важен выбор антикоагулянта (см.), а также особая обработка посуды, исключающая повреждение тромбоцитов, их прилипание к поверхности посуды и спонтанную Агглютинацию.

Для реакции рекомендуется брать взвесь тромбоцитов в концентрации 150 000-250 000 клеток в 1 мкл.

Готовую взвесь тромбоцитов (перед тем как смешать с сывороткой) отстаивают в течение 30 мин. Испытуемая и контрольные сыворотки предварительно прогреваются при t° 56° в течение 30 мин. Реагирующую смесь помещают в термостат на 1 час. при 37°. Оценку реакции проводят под микроскопом при благополучном контроле по четырехбалльной системе. Однако более четкие результаты по изучению антигенного состава тромбоцитов получают при использовании реакции связывания комплемента (см.).

Реакция Агглютинации имеет две фазы. Первая фаза — специфическая, сводится к соединению антигенов бактерий, эритроцитов и других клеток, а также антигенов, адсорбированных на поверхности индифферентных частиц, с агглютинирующими антителами. Вторая фаза — неспецифическая, которая проявляется Агглютинацией. эритроцитов, бактерий, лейкоцитов, индифферентных частиц с нагруженным на них комплексом антиген — антитело.

Реакция Агглютинации, в отличие от реакции преципитации, может быть положительной при очень больших разведениях сыворотки. Точное количество антител, необходимое для того, чтобы вызвать реакцию Агглютинации, не известно. Показано, что общий объем продукта реакции Агглютинации всегда превышает исходный объем бактерий, но степень увеличения объема всегда различна и зависит от многих трудно учитываемых причин. Положительная реакция Агглютинации может быть вызвана количеством антител, во много раз меньшим, чем количество антител, способное адсорбироваться антигенами на поверхности клеток, бактерий или частиц. В некоторых случаях при постановке реакции Агглютинации могут наблюдаться зоны задержки. Отсутствие Агглютинации при больших разведениях сыворотки называется постзоной, а при малых разведениях — прозоной. Было установлено, что задержка реакции Агглютинации при максимальном количестве специфических антител вызывается ингибиторами, которые снижают силы сцепления бактерий. Неагглютинирующиеся бактерии после отмывания их снова становятся агглютинабельными при больших разведениях той же сыворотки. Надосадочная жидкость содержит ингибиторы, которые могут снижать сцепление бактерий, обработанных сыворотками. Ингибиторы, вызывающие прозону в реакции Агглютинации, имеют сходство с блокирующими антителами (см. Антитела).

Применение в научных исследованиях по иммунологии различных абсорбентов дало возможность моделировать процессы взаимодействия антигенов и антител на поверхности адсорбентов. Одной из удобных моделей для изучения закономерностей реакции Агглютинации являются эритроциты, нагруженные различными антигенами.

Было установлено, что взаимодействие нативных эритроцитов с полисахаридами кишечной палочки, возбудителем холеры, чумы и других бактерии подчиняется закономерностям химической реакции.

В настоящее время нет теории механизма реакции Агглютинации, удовлетворительно объясняющей все известные экспериментальные данные (см. Антиген — антитело реакция). В литературе известны теория адсорбции Борде, теория решетки Маррака. теория окклюзии Бойда и др. Наибольшее распространение получила теория решетки, согласно которой предполагается, что антитела имеют не менее двух активных центров, способных соединяться с детерминантными группами антигенов. Молекула специфического антитела, соединяясь с детерминантами двух или более антигенов, образует решетку — агрегат, который при наличии в среде электролитов выпадает в осадок. Реакция Агглютинации не происходит с неполными антителами. Считали, что неполные антитела имеют только один активный центр, следовательно, они могут только соединяться с антигеном, но не могут образовать агрегатов, которые выпадают в осадок. Высказано предположение, что неполные антитела тоже двухвалентные, но их активные центры расположены так близко друг к другу, что не могут одновременно соединиться с двумя молекулами антигена. Кроме того, известно, что обработка неполных антител или эритроцитов трипсином влечет за собой нормальное проявление второй фазы реакции Агглютинации. Обнаружение неполных антител возможно с помощью реакции Агглютинации: эритроциты, сенсибилизированные неполными антителами, могут быть использованы как антиген, если на них подействовать специфической антиглобулиновой сывороткой (см. Кумбса реакция).

Агглютинация в судебно-медицинском отношении — см. Группы крови.

См. также Серологические исследования.

Библиография: Адамов А. К. Принципы быстрого обнаружения патогенных микробов и вирусов, Саратов, 1964, библиогр.; Бойд У. Основы иммунологии, пер. с англ., с. 274, М., 1969; Говалло В. И. Реакции, основанные на феномене агглютинации, в кн.: Лабораторные методы исследования в неинфскционной иммунологии, под ред. О. К. Вязова, с. 73, М., 1967; Гостев В. С. Реакция антиген — антитело. Многотомн. руководство по микробиол., клин, и эпидемиол. инфекц. болезней, под ред. Н. Н. Жукова-Вережникова т. 3, с. 117, М., 1964, библиогр.; Косяков П. Н. Иммунология изоантигенов и изоантител, М., 1965, библиогр.; Мейер М. Экспериментальная жхмунохимия, пер. с англ.,с. 106, М., 1968;

А. Т. Кравченко.

Источник