Белок в моче количественный метод

Патологическая протеинурия является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи. Выявление и количественная оценка протеинурии важна не только в диагностике многих первичных и вторичных заболеваний почек, оценка изменения выраженности протеинурии в динамике несет информацию о течении патологического процесса, об эффективности проводимого лечения. Обнаружение белка в моче даже в следовых количествах должно настораживать в отношении возможного заболевания почек или мочевых путей и требует повторного анализа. Особо следует отметить бессмысленность исследования мочи и, в частности, определения белка мочи без соблюдения всех правил ее сбора.

Все методы определения белка в моче можно разделить на:

• Качественные,
• Полуколичественные,
• Количественные.

Качественные методы

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков к денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка.

Условия определения белка в моче на основе реакции коагуляции:

1. Моча должна иметь кислую реакцию. Мочу щелочной реакции подкисляют несколькими (2 — 3) каплями уксусной кислоты (5 – 10%).
2. Моча должна быть прозрачной. Помутнение устраняется через бумажный фильтр. Если помутнение не исчезает, добавляют тальк или жженую магнезию (около 1 чайной ложки на 100 мл мочи), взбалтывают и фильтруют.
3. Качественную пробу следует проводить в двух пробирках, одна из них – контрольная.
4. Искать помутнение следует на черном фоне в проходящем свете.

К качественным методам определения белка в моче относятся:

• кольцевая проба Геллера,
• проба с 15 – 20% сульфосалициловой кислотой,
• проба с кипячением, и другие.

Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. Несмотря на это, в большинстве КДЛ в России эти методы широко используются в качестве скрининга – в моче с положительной качественной реакцией в дальнейшем проводят количественное определение белка. Из качественных реакций чаще используют пробу Геллера и пробу с сульфосалициловой кислотой, однако пробу с сульфосалициловой кислотой большей частью считают наиболее подходящей для выявления патологической протеинурии. Проба с кипячением в настоящее время практически не используется в связи с ее трудоемкостью и длительностью.

Полуколичественные методы

К полуколичественным методам относятся:

• метод Брандберга-Робертса-Стольникова,
• определение белка в моче с помощью диагностических тест-полосок.

В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера, поэтому при данном методе наблюдаются те же ошибки, что и при пробе Геллера.

В настоящее время для определения белка в моче все чаще используются диагностические полоски. Для полуколичественного определения белка в моче на полоске в качестве индикатора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. Несмотря на большую популярность и очевидные преимущества методов сухой химии (простота, скорость выполнения анализа) данные методы анализа мочи в целом и определения белка в частности не лишены серьезных недостатков. Одним из них, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. В связи с этим, тест-полоски в основном приспособлены к обнаружению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически весь белок мочи представлен альбумином. При прогрессировании изменений и переходе селективной гломерулярной протеинурии в неселективную (появление в моче глобулинов) результаты определения белка оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями. Данный факт не дает возможности использовать данный метод определения белка в моче для оценки состояния почек (гломерулярного фильтра) в динамике. При тубулярной протеинурии результаты определения белка также оказываются заниженными. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью улавливать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л). Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов.

Хлопья слизи с высоким содержанием гликопротеидов (например, при воспалительных процессах в мочевых путях, пиурии, бактериурии) могут оседать на индикаторной зоне полоски и приводить к ложноположительным результатам. Ложноположительные результаты могут также быть связаны с высокой концентрацией мочевины. Плохое освещение и нарушение цветоощущения может быть причиной неточного результата.

В связи с этим, использование диагностических полосок следует ограничить скринирующими процедурами, а результаты, полученные с их помощью, следует рассматривать лишь как ориентировочные.

Количественные методы

Корректное количественное определение белка в моче в ряде случаев оказывается непростой задачей. Трудности ее решения определяются следующим рядом факторов:

• низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов;
• присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций;
• значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.

В клинических лабораториях преимущественно применяются так называемые «рутинные» методы определения белка в моче, однако они далеко не всегда позволяют получать удовлетворительные результаты.

С точки зрения специалиста-аналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям:

• обладать линейной зависимостью между поглощением образовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию;
• должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций;
• обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала;
• быть устойчивым к воздействию различных факторов (колебаниям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.);
• обладать приемлемой стоимостью;
• быть легко адаптируемым к автоанализаторам;
• результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи.

Ни один из известных к настоящему времени методов количественного определения белка в моче не может в полной мере претендовать на роль «золотого стандарта».

Количественные методы определения белка в моче можно разделить на турбидиметрические и колориметрические.

Турбидиметрические методы

К турбидиметрическим методам относятся:

• определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),
• определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),
• определение белка с бензетоний хлоридом.

Турбидиметрические методы основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Величина светорассеяния в преципитационных методах обнаружения белка в моче зависит от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения pH среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению относительно воспроизводимых результатов.

Некоторые лекарственные препараты влияют на результаты турбидиметрических методов определения белка в моче, приводя к так называемым «ложноположительным», либо «ложноотрицательным» результатам. К ним относятся некоторые антибиотики (бензилпенициллин, клоксациллин и др.), рентгеноконтрастирующие йодсодержащие вещества, сульфаниламидные препараты.

Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации, часто приводят к получению ошибочных результатов, но, несмотря на это, в настоящее время они широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов. Наиболее широко в России используется метод определения белка с сульфосалициловой кислотой.

Колориметрические методы

Наиболее чувствительными и точными являются колориметрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков.

К ним относятся:

1. биуретовая реакция,
2. метод Лоури,
3. методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками:
   • Понсо S (Ponceau S),
   • Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue)
   • пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).

С точки зрения исполнителя, в повседневной работе лаборатории при большом потоке исследований биуретовый метод является неудобным из-за большого числа операций. В то же время, метод характеризуется высокой аналитической надежностью, позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций и выявлять альбумин, глобулины и парапротеины со сравнимой чувствительностью, вследствие чего биуретовый метод рассматривают в качестве референтного и рекомендуют для сравнения других аналитических методов обнаружения белка в моче. Биуретовый метод определения белка в моче предпочтительно выполнять в лабораториях, обслуживающих нефрологические отделения, и использовать в тех случаях, когда результаты определения с помощью других методов представляются сомнительными, а также для определения величины суточной потери белка у нефрологических больных.

Метод Лоури, обладающий более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод не всегда обеспечивает получение надежных результатов при определении содержания белка в моче. Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой, углеводами). Отделение этих и других компонентов мочи путем диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на данный метод и извращать результаты исследования.

Достаточная чувствительность, хорошая воспроизводимость и простота определения белка по связыванию красителей делают эти методы перспективными, однако высокая стоимость реактивов препятствует более широкому их использованию в лабораториях. В настоящее время в России все большее распространение получает метод с пирогаллоловым красным.

Проводя исследование уровня протеинурии, нужно иметь ввиду, что различные методы определения протеинурии имеют разную чувствительность и специфичность к многочисленным белкам мочи.

Исходя из эмпирических данных, рекомендуется определять белок двумя разными методами и рассчитывать истинное значение по одной из приведенных формул:

протеинурия = 0,4799 B + 0,5230 L;
протеинурия = 1,5484 B – 0,4825 S;
протеинурия = 0,2167 S + 0,7579 L;
протеинурия = 1,0748 P – 0,0986 B;
протеинурия = 1,0104 P – 0,0289 S;
протеинурия = 0,8959 P + 0,0845 L;

где:
B – результат измерения с Кумасси G-250;
L — результат измерения с реактивом Лоури;
P — результат измерения с молибдатом пирогаллола;
S — результат измерения с сульфосалициловой кислотой.

Учитывая выраженные колебания уровня протеинурии в различное время суток, а также зависимость концентрации белка в моче от диуреза, различное его содержание в отдельных порциях мочи, в настоящее время при патологии почек принято оценивать выраженность протеинурии по суточной потере белка с мочой, то есть определять так называемую суточную протеинурию. Она выражается в г/сут.

При невозможности сбора суточной мочи рекомендуется определять в разовой порции мочи концентрации белка и креатинина. Поскольку скорость выделения креатинина в течение дня достаточно постоянна и не зависит от изменения скорости мочеотделения, отношение концентрации белка к концентрации креатинина постоянно. Данное отношение хорошо коррелирует с суточной экскрецией белка и, следовательно, может использоваться для оценки выраженности протеинурии. В норме отношение белок/креатинин должно быть менее 0,2. Белок и креатинин измеряют в г/л. Важным достоинством метода оценки выраженности протеинурии по соотношению белок-креатинин является полное исключение ошибок, связанных с невозможностью или неполным сбором суточной мочи.

Литература:

• О. В. Новоселова, М. Б. Пятигорская, Ю. Е. Михайлов, «Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии», Справочник заведующего КДЛ, № 1, январь 2007 г.
• А. В. Козлов, «Протеинурия: методы ее выявления», лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.
• В. Л. Эмануэль, «Лабораторная диагностика заболеваний почек. Мочевой синдром», — Справочник заведующего КДЛ, № 12, декабрь 2006 г.
• В.И. Пупкова, Л.М. Прасолова — Определение белка в моче и спинномозговой жидкости. Кольцово, 2007 г.
• Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е. А. Кост. Москва, «Медицина», 1975 г.