Анализ мочи с реактивом эрлиха положительный причины
Применение реактива Эрлиха для скрининга заболеваний, связанных с нарушением порфиринового обмена
Автор: И.В.Смирнов, В.В.Гладун, А.А.Левина.
Гематологический Научный Цент РАМН, Москва, ИЧП «Агат», Москва.
(Проблемы гематологии и переливания крови, 1/98, стр.49-50.)
Увеличение выделения порфобилиногена (ПБГ) с мочой наблюдается при анемиях, связанных с нарушением порфиринового обмена. ПБГ является одним из главных маркеров острого состояния (атаки) при порфириях (острой перемежающей порфирии и порфирии Veriegata), в основе патогенеза которых лежат нарушения в синтезе гема, вызываемые дефицитом одного из ферментов его синтеза и экскрекцией с мочой предшественников — протопорфиринов.
Ввиду того, что клинически острые состояния при порфириях характеризуются комплексом терапевтических, нейрологических и психиатрических симптомов, таких как абдоминальные боли, тахикардия, гипертензия, поведенческие изменения, конвульсии, кома, парез дыхательной мускулатуры и др., определение ПБГ в моче наиболее целесообразно в нейрологических, психиатрических и хирургических стационарах.
В то же время при порфириях недопустимо применение целого ряда широко распространенных лекарств (барбитураты, этанол, хлорпропанид, сульфаниды и др.), поскольку они могут вызвать атаку порфирии. Поэтому определение ПБГ является основой для своевременной диагностики и адекватной терапии, поскольку в настоящее время существует препарат аргинат гематина (нормосанг), позволяющий купировать атаку при порфириях.
Обычно ПБГ, а также два других продукта порфиринового обмена — 5-d-аминолевулиновую кислоту (5-АЛК) и общие порфирины, количественно определяют методом колоночной хроматографии (например с применением наборов фирмы BioRad (США)). Определение этих показателей наиболее информативно для диагностики нарушений порфиринового обмена, однако реактивы эти чрезвычайно дороги, а методика сложна, что делает ее применение нецелесообразным в рамках рядового лечебного учреждения.
Определение ПБГ (а также 5-АЛК) можно проводить и по упрощенной схеме, применяя реактив Эрлиха, считая данный метод скринирующим, а при положительной реакции подтверждать указанными выше методами или обращаться в профильные лаборатории.
Реактив Эрлиха представляет собой раствор п-диметиламинобензальдегида 20 г/л в смеси ледяной уксусной и перхлорной кислот. При взаимодействии ПБГ с реактивом Эрлиха образуется порфобилиноген-альдегид, имеющий красную окраску. В качестве образца берется моча в первые 2-3 часа после мочеиспускания.
В ходе определения ПБГ к 0,5 мл мочи приливают 0,5 мл реактива Эрлиха. Реакцию следует считать положительной, если в первые 5 минут после добавления реактива Эрлиха произошло резкое изменение окраски (покраснение). При инкубации реакционной смеси более 5 мин возможно развитие окраски, не связанное с увеличением уровня ПБГ.
Используя хроматографические методы анализа, мы провели дифференциальную диагностику 65 больных, у которых наблюдались некоторые симптомы ОПП. У 25 больных диагноз ОПП был подтвержден. Применяя реактив Эрлиха по указанной методике, мы не обнаружили расхождения этого метода с данными колоночной хроматографии. Во всех положительных случаях наблюдалось резкое покраснение не позднее, чем через 1 мин, а в отрицательных — изменение окраски ранее, чем через 5 мин, не выявлено.
Учитывая тот факт, что в некоторых случаях при атаке при острой перемежающей порфирии вначале резко повышается содержание 5-d-аминолевулиновой кислоты (5-AЛК), которая также является предшественником порфиринов, рекомендуется, при наличии клинических симптомов и отрицательной пробы на ПБГ, провести определение 5-AЛК.
Для этого следует к 1 мл исследуемой мочи прибавить 0,5 мл ацетилацетона и пробу прогреть в водяной бане при 100.С в течение obr>10-15 мин. Затем прибавить 0,5 мл реактива Эрлиха и если в первые 5 минут произошло покраснение, то реакцию можно считать положительной.
Необходимо помнить, что в случае хранения мочи свыше 3 часов при комнатной температуре реакция может стать ложноотрицательной, что, по-видимому, связано с превращением ПБГ в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2-3 часа, ее хранят в холодильнике при 4.С или в замороженном состоянии. При доведении рН мочи до 6,0-7,0 и хранении в холодильнике ПБГ стабилен длительное время.
Кроме того, посуда, используемая для проведения реакции должна быть свободна от следов моющих средств, которые могут вызвать ложноположительную реакцию.
При ярко выраженной положительной реакции на ПБГ или 5-АЛК и наличии клинических симптомов следует принять меры, необходимые для предупреждения атаки или ее купирования. Однако, данный метод является скрининговым, а его положительный результат лишь указывает на возможность наличия нарушений порфиринового обмена. Для установления диагноза, а также для определения динамики заболевания и его лечения требуется количественное определение ПБГ, АЛК, и общих порфиринов хромотографическим методом. Рекомендуется при обнаружении положительной реакции обращаться Гематологический Научный Цент РАМН (ГНЦ РАМН).
В настоящее время ООО «Агат-Мед» выпускает набор реактивов для качественного определения порфобилиногена в моче «ПБГ АГАТ».
Cайт Гематологического Научного Центра РАМН, посвященный порфирии
Назад к списку
Источник
«Многоликая» острая Порфирия
Уважаемые читатели, предлагаем вашему вниманию материал, посвященный редкому и малоизвестному широкому кругу практических врачей заболеванию.
При неправильной диагностике, а следовательно и лечении, оно является смертельным (летальность, в среднем, составляет 60%) и, напротив, четкая своевременная диагностика и адекватная терапия спасают практически всех больных, возвращая их к нормальной полноценной жизни. Особенность этой патологии такова, что в результате полисиндромности ее клинических проявлений больные могут поступать в стационары различных профилей, где многие врачи-специалисты оказываются привлеченными в процесс лечения. Пациенты с неясным диагнозом могут переходить из одной клиники в другую, получать разную терапию до тех пор, пока, в лучшем случае, им не поставят правильный диагноз, а в худшем — не наступит летальный исход. Поэтому мы решили ознакомить с этой патологией как можно большее число людей, чтобы в будущем в любой больнице могли ее правильно диагностировать и вовремя оказать больному квалифицированную помощь.
Что же такое острая порфирия?
Острые порфирии — это группа наследственных заболеваний, в основе которых лежит нарушение биосинтеза гема, приводящее к избыточному накоплению в организме порфиринов и их предшественников, а именно, порфобилиногена (ПБГ) и δ-аминолевулиновой кислоты (АЛК). Избыток этих веществ оказывает токсическое воздействие на организм и обуславливает характерную клиническую симптоматику. Причиной подобного нарушения является мутация гена, ответственного за активность одного из ферментов, участвующих в многостадийном синтезе гема.
Классификация острых порфирий
• острая перемежающаяся порфирия (шведская порфирия) — аутосомно-доминантный тип наследования. Проявление — в 10-50% случаев носительства. Дебют в возрасте полового созревания; • наследственная копропорфирия — аутосомно-доминантный тип наследования. Дебют в возрасте полового созревания; • вариегатная порфирия — аутосомно-доминантный тип наследования. Дебют в возрасте полового созревания; • порфирия, связанная с дефицитом АЛК-дегидратазы — наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Дебют в младенчестве — полинейропатия.
Самой распространенной среди них является острая перемежающаяся порфирия (ОПП). Что касается порфирии, связанной с дефицитом АЛК-дегидратазы, то с 60-ых годов, когда профессор Л.И.Идельсон начал впервые в нашей стране заниматься этой патологией, ни один случай этого редчайшего заболевания не был зарегистрирован. Поэтому далее мы будем говорить только о первых трех формах острой порфирии.
Практически все пациенты с острой порфирией, за единичным исключением, гетерозиготны по дефектному гену, ответственного за синтез соответствующего фермента. Большинство из них не имеет очевидных симптомов заболевания, поскольку активности фермента, сниженной до ~ 50%, достаточно для поддержания нормальной скорости биосинтеза гема. Как показывает опыт, почти 85% носителей аномального гена проживают жизнь, не зная об этой болезни. У остальной части, преимущественно у женщин, в период после полового созревания острое течение заболевания может быть спровоцировано действием ряда факторов.
Факторы, провоцирующие острое течение заболевания
Наиболее распространенными являются следующие:
• лекарственные препараты (включая пероральные контрацептивные средства); • контакт с ядохимикатами (к примеру, с/хозяйственные удобрения); • нарушение гормонального профиля у женщин в предменструальный период или при беременности; • резкое изменение характера питания, голодание; • инфекционные заболевания; • стрессовые ситуации; • прием алкоголя.
Самое первое описание острого приступа порфирии было свя-зано с использованием сульфонала. На сегодняшний день наиболее распространенными медикаментозными препаратами — индукторами острого течения заболевания — являются анальгетики, сульфаниламидные и барбитуратные препараты. Все больные и скрытые носители этой патологии, а также клиницисты, сталкивающиеся с лечением острой порфирии, обязательно должны иметь при себе списки препаратов, безопасных и небезопасных для применения при острой порфирии. Ежегодно эти списки обновляются и публикуются Шведским центром порфирии.
Поскольку другим очень распространенным фактором, провоцирующим заболевание, является гормональный, то этот факт объясняет более частое проявление острой порфирии у женщин в сравнении с мужчинами.
Клиника острой порфирии
Суммируя опыт собственных наблюдений а также других исследователей, занимающихся острыми порфириями, представляем наиболее характерные клинические симптомы этого заболевания:
I. Абдоминальный: • боли в животе — как правило в эпигастральной или правой подвздошной областях, реже не имеют четкой локализации; чаще всего носят приступообразный характер, иногда бывают постоянными, продолжающимися несколько часов или дней; • тошнота, рвота; • запор, реже понос.
II. Сердечно-сосудистый: • стойкая синусовая тахикардия (до 160 ударов в минуту); • гипертония.
III. Неврологический: • мышечная атония (затрагивает чаще мышцы конечностей и пояса); • боли в конечностях, голове, шее и грудной клетке; • потеря чувствительности (наиболее выражена в плечевой и бедренной областях); • поражение черепно-мозговых нервов (в виде дисфагии, диплопии, афонии, пареза лицевого и глазодвигательного нервов); • нарушение тазовых функций; • двигательные расстройства в виде вялых парезов и параличей; • паралич дыхания.
IV. Расстройства психики: • бессонница; • сильное беспокойство; • депрессивные и истерические компоненты; • спутанность сознания и дезориентация; • зрительные и слуховые галлюцинации; • тонико-клонические судороги; • мании; • коматозное состояние; • эпилептические припадки.
V. Кожный (только для больных с наследственной копропорфирией и вариегатной порфирией): • повышенная фоточувствительность; • изменение пигментации.
Исходя из перечисленных симптомов, логично сделать следующий вывод. Острую порфирию можно подозревать у любого больного, поступающего в клинику с неожиданной абдоминальной болью, периферической нейропатией или с нарушением психики. В каждом индивидуальном случае может наблюдаться либо целый набор перечисленных симптом, либо только отдельные из них.
Зачастую больные с острыми приступами порфирии проходят многоэтапные мытарства по различным отделениям клиник, включая хирургические, урологические, гинекологические, неврологические и психосоматические. При отсутствии правильного диагноза история болезни не редко может иметь следующий печальный конец: Тошнота и рвота, нестерпимые сильные боли в животе, отсутствие стула и перистальтики ошибочно наводят на мысль об острой хирургической патологии. Выполняемые в этих случаях хирургические вмешательства с применением барбитуратов в качестве вводного наркоза приводят к усугублению течения заболевания: развивается тетраплегия с параличом дыхательной, артикуляционной и фонирующей мускулатуры. Как следствие, больных подключают к аппарату искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Часто ИВЛ осложняется пневмонией, тяжелой дыхательной недостаточностью, от которой наступает смерть больного. При этом диагноз теряется среди наименований, обозначающих острую полинейропатию с тетраплегией и выключением дыха-тельной мускулатуры (синдром Гийана-Барре, вирусный полирадикулоневрит, отравление суррогатами алкоголя и т.д.).
Таким образом, все неясные больные с подобной клинической картиной должны быть обязательно обследованы на наличие у них острой порфирии. Своевременная диагностика этой патологии просто необходима, поскольку правильно установленный диагноз и верно выбранная тактика лечения приводят всех больных к клиническому выздоровлению.
Диагностика острой порфирии
Первое, на что необходимо обратить внимание при диагностике, — изменился ли цвет мочи у больного. Появление окрашенной мочи от слегка розового до красно-бурого цвета является характерным, но необязательным признаком данного заболевания. В период его обострения наблюдается высокая экскреция с мочой порфиринов, порфобилиногена и дельта-аминолевулиновой кислоты. Высокое содержание порфиринов объясняет розовый цвет мочи, а избыток порфобилина, продукта деградации порфобилиногена, окрашивает мочу в красно-бурый цвет. При стоянии мочи на свету необычное окрашивание становится еще более заметным.
Однако изменение цвета мочи не является обязательным признаком острой порфирии. Существует ряд скрининговых качественных методов, позволяющих в обычных больничных условиях с большой долей вероятности обнаружить наличие порфиринов и порфобилиногена в моче. Проводить их необходимо в момент острого течения заболевания, чтобы избежать возможных ошибок. Ниже представим описание двух из них.
1. Скрининговый (ориентировочный) тест на присутствие порфиринов в моче.
Принцип теста: Моча здорового человека под действием ультрафиолета в диапазоне длин волн 320-405 нм люминесцирует бело-голубым цветом. Когда же в моче присутствует избыток порфиринов, она имеет красную флюоресценцию.
Реагенты: • Ледяная уксусная кислота; • Амиловый спирт.
Метод: В пробирку к 4 мл свежей мочи добавить 10 капель ледяной уксусной кислоты и 1 мл амилового спирта, хорошо перемешать и подождать полного разделения слоев. Розовая или красная флюоресценция верхнего органического слоя указывает на присутствие избытка порфиринов в моче.
Возможны ложноположительные результаты данного теста, но редко. Необходимо помнить, что при некоторых отравлениях (к примеру, свинцом, ртутью, мышьяком), прогрессирующих заболеваниях печени или пернициозной анемии наблюдается умеренное повышение выделения копропорфирина в мочу.
2. Качественная реакция мочи с реактивом Эрлиха на присутствие порфобилиногена.
Принцип теста: Порфобилиноген реагирует с реактивом Эрлиха, образуя в кислом растворе окрашенный продукт розово-красного цвета. Поскольку эта реакция может происходить с другими веществами, присутствующими в моче, в тесте используется экстракция и регулировка рН раствора для исключения влияния мешающих веществ.
Образец: Тест проводится с использованием только свежесобранной мочи без добавления консерванта, защищенной от контакта со светом и хранящаяся в холодном месте до момента проведения анализа. Образец ранней утренней мочи является предпочтительным, поскольку моча является более концентрированной. Моча, собранная более чем 4 часа назад, не может быть использована для анализа, поскольку концентрация ПБГ снижается на 20% в течение 24 часов при комнатной температуре. При хранении образца при — 200С уровень ПБГ в моче может быть стабилен в течение 6 месяцев.
Реагенты: • Реактив Эрлиха (0.7 г пара-диметиламинобензальдегида рас-творить в 100 мл Н2О дист., а затем добавить 150 мл НCl конц.) Хранится в темном флаконе, стабилен в течение 6 месяцев; • Насыщенный раствор ацетата натрия: 120 г CH3COONa растворить в 100 мл горячей (70-800С) дистиллированной воды; • Смесь амилового и бензилового спиртов в соотношении 3:1 (v/v); • Индикаторная бумага рН 4-5; • Реагент сравнения: разбавить 150 мл НСl конц. в 100 мл Н2О дист.
Метод: 1.) Добавить 0.5 мл реактива Эрлиха в стеклянную пробирку с 0.5 мл исследуемой мочи и перемешать. Подождать в течение 3-5 мин развития окраски и добавить при перемешивании 1 мл насыщенного раствора ацетата натрия. Проверить с помощью индикаторной бумаги, чтобы рН раствора был в диапазоне от 4 до 5. Если окраска не появится, то ПБГ не обнаружен. Если в течение 3-4 мин. содержимое пробирки приобретет розовый или красный цвет, то переходите к следующим пунктам исследования; 2.) Чтобы исключить присутствие мешающих веществ, повторить процедуру из пункта (1) с реагентом сравнения. Если снова появится розовая окраска, то вероятно в моче содержится кислотный индикатор (например, метиловый красный), который случайно попал в мочу после применения либо лекарственных пре-паратов, содержащих красители, либо легких алкогольных напитков, либо пищевых продуктов с различными добавками; 3.) Для исключения уробилиногена, как причины появления розовой окраски, добавить приблизительно 2 мл смеси намилового и бензилового спиртов в пробирку с содержимым из пункта (1). Хорошо перемешать путем встряхивания и дать разделиться слоям. Комплекс уробилиногена с реактивом Эрлиха должен проэкстрагироваться в верхний органический слой. Розовая окраска нижнего водяного слоя указывает на присутствие ПБГ.
В Москве фирма «Агат» выпускает реактив Эрлиха с разработанной подробной инструкцией по проведению скрининг-теста. Телефон для справок: +7 (495) 777-4192.
Этот тест почти всегда положителен про острых приступах порфирии, правда, иногда можно получить ложноположительный результат за счет вероятного присутствия в моче мешающих веществ.
Отрицательный результат теста на ПБГ снижает вероятность, но окончательно не исключает диагноз острой порфирии. Объяснением тому может служить либо наличие в моче некоторых веществ — ингибиторов, которые приводят к ложноотрицательному результату, или незначительное повышение концентрации ПБГ, что может быть ниже предела чувствительности скрининг-теста. Кроме того, при вариегатной порфирии, наследственной копро-порфирии и только в очень редких случаях при ОПП экскреция ПБГ в мочу может быстро снижаться и вернуться к нормальной в течение нескольких дней после острого приступа. Поэтому, если клинически диагноз острой порфирии до конца не отвергается, необходимо провести количественное определение порфиринов и их предшественников в моче.
Качественный тест с реактивом Эрлиха широко используется в клиниках многих стран, особенно в Скандинавии, Англии и Ирландии (где зафиксировано наибольшее число случаев заболева-ния острой порфирией) в качестве скрининга для быстрого выявления вероятных порфирий. Наладить первичную диагностику острых порфирий в каждой клинике России на основе вышеизложенных качественных тестов — является важной и не терпящих отлагательств задачей. Ее выполнение не требует особых финансо-вых и трудоемких затрат, с одной стороны, а с другой — многим больным острой порфирии уже на первых этапах развития болезни будет поставлен верный диагноз, что позволит своевременно провести необходимое лечение. В результате многие пациенты будут возвращены к здоровому образу жизни, минуя получения группы инвалидности при затяжном течении заболевания.
Качественные скрининг-тесты ни в кой мере нельзя принимать за абсолютные, в связи с возможными, указанными выше ошибками. Для подтверждения и уточнения диагноза рекомендуется провести следующие лабораторные исследования: 1.) Определение общих порфиринов и их предшественников — порфобилиногена (ПБГ) и δ-аминолевулиновой кислоты (АЛК) в моче. В норме содержание общих порфиринов в моче не превышает 0.15 мг/л; ПБГ — 2 мг/л; АЛК — 4.5 мг/л.; 2.) Определение общих порфиринов в кале. У здоровых людей содержание общих порфиринов в кале <200 нмоль/г сухого веса; 3.) Определение активности фермента порфобилиноген-дезаминазы (в случае ОПП), копро-порфириноген-оксидазы (в случае наследственной копро-порфирии) и протопорфириноген-оксидазы (в случаи вариегатной порфирии); 4.) Проведение молекулярного анализа ДНК.
Количественное исследование порфиринов и их предшественников в моче позволяет уже на первых этапах диагностики точно поставить диагноз острой порфирии, а с помощью ряда дополнительных исследований определить тип порфирии. Как правило, третий и четвертый этапы в диагностике необходимы при обнаружении бессимптомных случаев носительства заболевания у членов семьи больного.
Заключение
Уважаемые читатели Редкого журнала, коллеги, мы надеемся, что после ознакомления с данным материалом, заболевание острая порфирия уже не будет для вас неизвестным. При встрече с похожими непонятными случаями в вашей медицинской практике вы сможете правильно поставить диагноз и своевременно, грамотно оказать квалифицированную помощь больному, что поможет избежать смертельный исход этого заболевания.
Еще раз подчеркнем, что основные усилия при проведении диагностики, особенно с помощью качественных методов, должны быть сделаны во время острого течения заболевания, поскольку задним числом диагноз поставить очень сложно.
За консультацией вы всегда можете обратиться в Гематологический Научный Центр Минздрава РФ, где создана специальная группа по диагностике, лечению и предоставлению консультативной помощи больным с порфирией и членам их семей. Возглавляет и координирует работу группы врач-гематолог, к.м.н. Пустовойт Ярослав Сергеевич, тел.: +7 (495) 612-2361; биохимической диагностикой занимается Карпова Ирина Владимировна, тел.: +7 (495) 614-9748, : karpova@blood.ru ; молекулярной диагностикой — Сурин Вадим Леонидович, тел.: +7 (919)720-9692, :vadsurin@mail.ru.
Источник